Сорбционные свойства мха по отношению к микроорганизмам и тяжелым металлам

Слегка касаясь бактериологической петлей поверхности среды, проводят от дна пробирки вверх зигзагообразную линию, тем самым, засевая культуру микроорганизмов. После посева пробирки помещают в термостат (30°С) на 1 сутки (по истечению этого срока пробирки извлекают из термостата) и заливают в них по 2.0-3.0 мл физиологического раствора (ФР). Осторожно отделяют микробную культуру от агара постепенным встряхиванием и покачиванием пробирки.

Полученную суспензию хранят в холодильнике. 2.1.2. Определение количества жизнеспособных клеток методом высева на плотную среду Микробную суспензию разводят в стерильном физиологическом растворе, при этом используя один и тот же коэффициент разведения. Посев осуществляют из 5-ого, 6-ого и 7-ого разведений перенося 0, 1 мл суспензии на поверхность питательного агара в чашках Петри. Затем суспензию равномерно распределяют шпателем по питательному агару. Высев из каждого разведения осуществляют стерильной пипеткой. После посева чашки помещают в термостат (30°С) на сутки.

Количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии рассчитывают по следующей формуле: M=a * 10 z / V; ( 2.1 )

БГТУ 02.00.ПЗ
Изм. Кол.уч. Лист № док. Подпись Дата
Разраб. Ковалевич А. Экспериментальная часть Стадия Лист Листов
Пров. 1 18
Консульт. БГТУ 7140607 2004
Н.контр.
Утв.
где M - количество клеток в 1 мл исходной суспензии; а - количество колоний, которые выросли на чашках Петри; Z - порядковый номер разведения суспензии; V - объем суспензии, взятой для высева на чашку Петри, мл.

Величину оптической плотности измеряют с помощью фотоколориметра ФЭК-56М. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, который обеспечивает максимум пропускания света данной суспензией. В результате опытов получили, что максимум пропускания света обеспечивает длина волны 540 нм. 2.1.3 . Изучение сорбции металлов мхом Для эксперимента на аналитических весах взвешивают образцы мха массой 200 + 0,5 мг и помещают их в стеклянные флаконы с привинчивающимися крышками объемом 100мл. Затем в эти же флаконы заливают по 50 мл раствора металла различной концентрации (для эксперимента были выбраны следующие концентрации металлов: 0,1; 0,02;0,005; 0,0001; 0,00002; 0,00001 моль/л), которые готовят путем последовательного разведения исходного раствора соли металла (0,1 моль/л). Флаконы закрывают и оставляют на 24 часа при комнатной температуре (18 + 2°С) при периодическом перемешивании. После чего мох из суспензии отфильтровывают через бумажный фильтр в колбы для титрования и титруют по следующим методикам. 2.1.3.1. Определение меди комплексонометрическим методом В качестве источника меди использовали сульфат меди. Ионы меди образуют с ЭДТА комплексы голубого цвета с константой устойчивости 6,3*10 18 (ионная сила 0,1: 20 °С). Анализируемый раствор разбавляют водой до метки в мерной колбе.

Равновесные растворы с исходной концентрацией 0,100 моль/л после фильтрования в количестве 48 мл разбавляют водой в мерной колбе до 100 мл. После перемешивания отбирают пипеткой аликвотную часть раствора в коническую колбу, прибавляют 20 мл дистиллированной воды, 5 мл буферного раствора, на кончике металлического шпателя 20-30 мг индикаторной смеси, растворяют ее и титруют раствором ЭДТА 0,0500 М до изменения окраски из зеленовато-желтого цвета в чисто-фиолетовую.

Измеряют объем ЭДТА и вводят 1 каплю 2 М раствора NH4ОН, если цвет раствора остается фиолетовым, титрование прекращают; если от добавления аммиака окраска изменилась в желтую или желто-зеленую, продолжают титрование раствором ЭДТА до устойчивой фиолетовой окраски. В качестве буферного раствора используют ацетатный буфер (ацетат аммония, 50% раствор) с pH6. Титрование ведут на холоду (при комнатной температуре 18 + 2°С). В качестве металлоиндикатора используют мурексид (смесь с хлоридом натрия в соотношении 1:100). Массу определяемого вещества рассчитывают по формуле (2.2.): m= (V1*Vж*c1*M)/(V2*1000) ( 2.2 ) где - V1 - объем раствора ЭДТА, пошедшего на титрование; V2 - объем анализируемого равновесного раствора (аликвотная часть); c1 - молярная концентрация ЭДТА; M - молярная масса определяемого вещества; Vж - объем мерной колбы, из которой отбирали аликвотную часть. 2.1.3.2. Определение кадмия комплексонометрическим методом В качестве источника кадмия в работе использовали ацетат кадмия.

Отбирают аликвотную часть анализируемого раствора из мерной колбы вместимостью 100 мл, прибавляют 2-3 мл буферного раствора с pH 10 (аммиачный буферный раствор: 67г NH4Cl и 570 мл 25%-ного NH3 в 1 л раствора), 15 мл воды, перемешивают и прибавляют на кончике шпателя 20-30 мг смеси индикатора эриохромового черного Т и хлорида натрия.

Перемешивают до полного растворения индикаторной смеси и титруют раствором ЭДТА 0,0500 М до изменения окраски раствора из винно-красной в голубую. Массу определяемого вещества рассчитывают по вышеуказанной формуле (2.2). 2.1.4. Определение кинетики сорбции металлов мхом В стеклянные флаконы помещают навески по 200 + 0,5 мг мха, взвешенные на аналитических весах.

Добавляют по 50 мл раствора металла 0,02 моль/л и тщательно перемешивают. Через 5, 10, 20, 30, 60 и 120 мин мох отфильтровывают из анализируемых растворов.

Фильтраты меди и кадмия оттитровывают раствором ЭДТА по вышеописанной методике. 2.1.5. Изучение сорбции металлов микроорганизмами В мерную колбу на 50 мл сначала добавляют 1 мл микробной суспензии, затем доводят объем до метки исследуемым раствором металла. После этого вливают содержимое мерной колбы во флаконы на 100 мл с привинчивающимися крышками.

Флаконы оставляют на 24 часа, по истечении которых растворы центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 минут. Далее раствор, отделенный от микроорганизмов, оттитровывают раствором ЭДТА по вышеописанной методике. 2.1.6. Определение кинетики сорбции металлов микроорганизмами В мерную колбу на 50 мл сначала добавляют 1 мл микробной суспензии, затем доводят объем до метки исследуемым раствором металла. После этого вливают содержимое мерной колбы во флаконы на 100 мл с привинчивающимися крышками. Через 5, 10, 20, 30, 60 и 120 мин отфильтровывают культуру микроорганизмов на микробном фильтре и фильтраты оттитровывают раствором ЭДТА. 2.1.7. Изучение сорбции металлов в системе мох-суспензия микроорганизмов В стеклянные флаконы помещают пробы мха 200 + 0,5 мг предварительно взвешенные на аналитических весах. Потом в эти же стеклянные флаконы добавляют 50 мл раствора металла различной концентрации. И затем добавляют 1 мл микробной суспензии. После этого систему при периодическом перемешивании оставляют на 24 часа. Через сутки исследуемые растворы отфильтровывают на микробном фильтре и титруют раствором ЭДТА по методикам указанным в пп. 2.1.3.1. и 2.1.3.2.. 2.1.8. Определение кинетики сорбции металлов микроорганизмами, адсорбированными на мхе В стеклянные флаконы с привинчивающимися крышками помещают навески мха массой 200 + 0,5 мг, 1 мл микробной суспензии и 50 мл раствора металла 0,02 моль/л. Через 5, 10, 20, 30, 60, 120 мин культуру микроорганизмов отфильтровывают через микробный фильтр и фильтраты оттитровывают раствором ЭДТА. 2.1.9. Получение кривой выживаемости микроорганизмов Выживаемость микроорганизмов изучают посевом их на чашки Петри с питательным агаром.

Микробную суспензию используют после обработки ее металлами в опыте по изучению сорбции металлов микроорганизмами. 2.1.10. Изучение адсорбции микроорганизмов мхом В мерную колбу на 50 мл сначала добавляют 1 мл микробной суспензии и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем переливают раствор микробной суспензии в качальную колбу и добавляют навески мха массой 200 + 0,5 мг. Все колбы ставят на качалку на 2 часа.

Измеряют оптическую плотность и делают высев на жизнеспособность.

Результаты представлены в таблице 2.8. 2.2. Результаты исследований и их обсуждение В качестве сорбента-носителя микроорганизмов использовался мох из класса мхи (Мusci) подкласса сфагновые, семейства сфагновые, Sphagnum cuspidatum. Данный вид мха был выбран в связи с тем, что он обладает значительным ареалом распространения в нашей республике. В качестве микроорганизмов, способных к поглощению тяжелых металлов, изучались Pseudomonas aeroginosa B7. Это прямые или слегка изогнутые палочки, размером 0,5-1 мкм.

Граммотрицательные, обладают подвижностью за счет одного полярного жгутика, тип дыхания - аэробы, метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода как конечного акцептора электронов, данные бактерии могут выделять в среду сине-зеленый пигмент.

Данные бактерии широко распространены, так, например, они часто встречаются при гнойных инфекциях в медицинских учреждениях.

Полученные экспериментальные данные в опыте по изучению сорбции металлов мхом (2.1.3.) сведены в таблицу 2.1. и представлены в виде изотерм сорбции на рисунках 2.1. и 2.2.. Таблица 2.1 Данные ионообменной сорбции металлов мхом

Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/г
Сульфат меди, CuSO4
0,2012 0,1 10 9,85 0,09855 0,72
0,1998 0,1 10 9,86 0,09863 0,68
0,2001 0,02 10 3,73 0,01865 0,67
0,2020 0,02 10 3,74 0,01868 0,66
0,1995 0,005 25 1,95 0,00389 0,55
0,1987 0,005 25 1,99 0,00397 0,51
Ацетат кадмия, Cd(CH3COO)2
0,2013 0,1 10 9,86 0,09864 0,69
0,2210 0,1 10 9,87 0,09871 0,66
0,1899 0,02 10 3,75 0,01876 0,62
0,2430 0,02 10 3,76 0,01880 0,60
0,2150 0,005 25 1,93 0,00386 0,57
0,2000 0,005 25 1,95 0,00390 0,55
> Рис.2.1. > Рис.2.2. Изотермы сорбции - это кривые, показывающие зависимость количества сорбированного вещества (мг-экв) в расчете на 1 г сорбента от равновесной концентрации этого вещества в моль/л.

Полученные результаты полностью соответствуют существующим сведениям об ионообменной емкости мха, которая по литературным сведениям считается равной 1мг-экв/г. На основании представленных рис.2.1. и 2.2. можно говорить, что мох является хорошим природным ионообменником и обладает хорошими сорбционными свойствами по отношению к тяжелым металлам, это достигается наличием в структуре мха таких веществ как полиурониды (полисахариды, содержащие карбоксильную группу в 6-пложении пиранового или ангидроглюкозного цикла) и пектина.

Сравнивания результаты сорбции ионов меди и ионов кадмия можно сделать вывод, что из исследованных тяжелых металлов лучше сорбируется мхом медь (Cu), чем кадмий (Cd). Это может быть связано в первую очередь с тем, что ионы меди лучше удерживаются карбоксильными группами мха в составе клеточной стенки мха, которые и отвечают в основном за ионообменную активность мха.

Полученные экспериментальные данные в опыте по изучению кинетики сорбции металлов мхом (2.1.4.) сведены в таблицу 2.2. и представлены в виде кинетических кривых сорбции на рисунках 2.3 и 2.4.. Таблица 2.2 Данные по кинетике сорбции металлов мхом

Время, мин Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/г
Ацетат кадмия, Cd(CH3COO)2
5 0,2014 0,02 10 3,99 0,01997 0,01
10 0,2218 0,02 10 3,94 0,01972 0,14
20 0,1899 0,02 10 3,92 0,01958 0,21
30 0,2434 0,02 10 3,86 0,01931 0,35
60 0,2156 0,02 10 3,81 0,01903 0,49
120 0,2213 0,02 10 3,81 0,01903 0,49
Сульфат меди, CuSO4
5 0,2266 0,02 10 3,82 0,01912 0,44
10 0,2312 0,02 10 3,80 0,01901 0,50
20 0,1899 0,02 10 3,77 0,01885 0,57
30 0,2001 0,02 10 3,75 0,01874 0,63
60 0,2166 0,02 10 3,73 0,01863 0,69
120 0,1959 0,02 10 3,73 0,01863 0,69
Рис.2.3.> Рис.2.4.> Под кинетическими кривыми сорбции принято понимать кривые, показывающие зависимость количества сорбированного вещества (ионов металла) от времени проведения сорбции, t, мин. По виду кинетических кривых можно говорить о том, что в системе «мох-раствор металла» достаточно быстро устанавливается равновесное состояние (рис.2.3, 2.4.). Так, уже через полчаса сорбируется 91% ионов меди и 72% кадмия. Также по виду кривой 2.3. можно говорить о присутствии у мха двух активных центров связывания ионов металла, об этом свидетельствуют две точки перегиба на кривой, т.е. основной вклад в сорбцию вносит ионообменная сорбция, а не физическая, т.к. в случае физической сорбции точек перегиба бы не было.

Результаты изучения сорбции металлов микроорганизмами (2.1.5.) сведены в таблицу 2.3. и представлены в виде изотерм сорбции металлов на рис.2.5.и 2.6.. Таблица 2.3 Данные по сорбции металлов микроорганизмами

Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/мл Количество сорбированного металла мг-экв/см3 плотно упакованных клеток
Ацетат кадмия, Cd(CH3COO)2
0,1945 0,1 10 9,98 0,09979 0,11 8,0046
0,2230 0,1 10 9,99 0,09986 0,08 5,6172
0,1981 0,02 10 3,96 0,01979 0,11 7,5130
0,2054 0,02 10 3,97 0,01986 0,07 4,9151
0,1980 0,005 25 2,38 0,00476 0,12 8,4258
0,1996 0,005 25 2,40 0,00480 0,10 7,0215
Продолжение таблицы 2.3
Сульфат меди, CuSO4
0,2032 0,1 10 9,93 0,09933 0,33 23,1711
0,1975 0,1 10 9,94 0,09941 0,29 20,3625
0,1987 0,02 10 3,89 0,01947 0,27 18,6071
0,2005 0,02 10 3,90 0,01948 0,26 18,2560
0,2400 0,005 25 2,24 0,00449 0,25 17,6943
0,2265 0,005 25 2,26 0,00451 0,24 16,8517
Рис.2.5.> Рис. 2.6.> Основываясь на результатах эксперимента можно говорить о том, что исследуемый штам микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa В7 обладает сорбционными свойствами по отношению к тяжелым металлам. Так, по отношению к кадмию в результате исследований (п.2.1.5) сорбционная емкость микроорганизмов - 0,114 мг-экв/мл суспензии, по меди - 0,29 мг-экв/мл суспензии.

Однако стоит отметить, что в настоящее время существуют более эффективные формы микроорганизмов, которые используются для биосорбции металлов из растворов, в том числе и штаммы данного рода. Из исследованных тяжелых металлов лучше сорбируется мхом и микроорганизмами медь (Cu), чем кадмий (Cd) (см. рис.2.5 и 2.6.) Можно сделать предположение о том, что это связано в первую очередь с тем, что в небольших количествах медь является одним из важнейших биогенных элементов, необходимых для развития микроорганизмов и наряду с сорбцией имеет место утилизация микроорганизмами ионов меди.

Результаты изучения кинетики сорбции микроорганизмами ионов металлов сведены в таблицу 2.4. и представлены в виде кинетических кривых.

Таблица 2.4 Данные по кинетике сорбции металлов микроорганизмами

Время, мин Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/мл Количество сорбированного металла мг-экв/см3 плотно упакованных клеток
Ацетат кадмия, Cd(CH3COO)2
5 0,1874 0,02 10 4,00 0,01999 0,01 0,3511
10 0,1755 0,02 10 3,98 0,01990 0,05 3,3703
20 0,2100 0,02 10 3,98 0,01988 0,06 4,3534
30 0,1990 0,02 10 3,97 0,01985 0,07 5,1257
60 0,1980 0,02 10 3,96 0,01982 0,09 6,2492
120 0,1996 0,02 10 3,96 0,01981 0,10 6,7407
Сульфат меди, CuSO4
5 0,1955 0,02 10 3,97 0,01985 0,07 5,1959
10 0,2230 0,02 10 3,96 0,01978 0,11 7,5833
20 0,1906 0,02 10 3,94 0,01971 0,15 10,2515
30 0,2054 0,02 10 3,93 0,01964 0,18 12,4281
60 0,1980 0,02 10 3,90 0,01949 0,26 17,9751
120 0,1996 0,02 10 3,90 0,01949 0,26 17,9751
> Рис. 2.7. > Рис.2.8. По виду кинетических кривых сорбции можно говорить, что основной вклад в сорбцию ионов металлов микроорганизмами вносит физическая сорбция, чтобы говорить о ионообменной сорбции необходимы дополнительные исследования.

Равновесное состояние устанавливается в течение часа. Также можно сказать, что сорбция меди идет быстрее.

Полученные результаты в экспериментах по изучению сорбции металлов в системе мох-суспензия микроорганизмов (п.2.1.6.) сведены в таблицу 2.5. и представлены в виде изотерм сорбции на рис. 2.9.и 2.10.. Таблица 2.5 Данные по сорбции металлов в системе мох-суспензия микроорганизмов

Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/г
Ацетат кадмия, Cd(CH3COO)
0,2156 0,1 10 9,84 0,09842 0,80
0,2643 0,1 10 9,85 0,09850 0,76
0,1986 0,02 10 3,69 0,01846 0,77
0,1921 0,02 10 3,70 0,01850 0,75
0,1896 0,005 25 1,73 0,00346 0,77
0,1955 0,005 25 1,71 0,00342 0,79
Сульфат меди, CuSO4
0,2000 0,1 10 9,80 0,09805 0,97
0,1955 0,1 10 9,81 0,09811 0,94
0,1970 0,02 10 3,63 0,01816 0,92
0,1979 0,02 10 3,64 0,01819 0,90
0,2053 0,005 25 1,62 0,00323 0,88
0,1990 0,005 25 1,61 0,00322 0,89
> Рис. 2.9 Рис.2.10.> По результатам этого эксперимента можно сделать вывод, что совместное использование мха и микроорганизмов значительно повышает эффективность биосорбции и улучшает поглощение тяжелых металлов из растворов этих металлов. Так, если мхом сорбируется 0,655 мг-экв(кадмия )/г, то при совместном использовании мха и микроорганизмов- 0,777 мг-экв/г и мл. Таким образом, эффективность сорбции увеличивается на 16% . При аналогичном сравнивании результатов сорбции по ионам меди эффективность увеличивается на 26%. Экспериментальные данные по изучению кинетики сорбции металлов микроорганизмами, адсорбированными на мхе сведены в таблицу 2.6. и представлены в виде кинетических зависимостей концентрации металла от времени на рис. 2.11. и 2.12.. Таблица 2.6. Данные по кинетике сорбции металла в системе мох-суспензия микроорганизмов
Время, мин Навеска мха, г Исходная концентрация соли металла, моль/л Объем аликвоты, мл Объем ЭДТА 0,05 моль/л пошедшего на титрование, мл Равновесная концентрация соли металла, моль/л Количество сорбированного металла, мг-экв/г
Ацетат кадмия, Сd(CH3COO)2
5 0,2251 0,02 10 3,95 0,01975 0,13
10 0,2643 0,02 10 3,95 0,01974 0,13
20 0,1986 0,02 10 3,93 0,01965 0,18
30 0,1921 0,02 10 3,93 0,01965 0,18
60 0,1896 0,02 10 3,69 0,01845 0,78
120 0,1955 0,02 10 3,69 0,01845 0,78
Сульфат меди, CuSO4
5 0,2312 0,02 10 3,79 0,01897 0,52
10 0,2087 0,02 10 3,79 0,01897 0,52
20 0,1982 0,02 10 3,79 0,01895 0,52
30 0,19 0,02 10 3,75 0,01873 0,64
60 0,191 0,02 10 3,68 0,01841 0,79
120 0,24 0,02 10 3,67 0,01833 0,83
Рис.2.11.> Рис.2.12.> По результатам эксперимента можно сделать следующие выводы: в системе быстро наступает равновесное состояние, так уже через 60 мин сорбируется 95% ионов меди, и 97% ионов кадмия; наличие на кинетических кривых двух точек перегиба свидетельствует о наличие у мха двух активных центров связывания и значимости ионообменной сорбции в суммарном процессе.

Результаты эксперимента по получению кривых выживаемости микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa (2.1.9.) представлены на рис. 2.13. и 2.14.. > Рис. 2.13. Рис.2.14.> Результаты данного эксперимента полностью соответствуют литературным сведениям о выживаемости микроорганизмов при воздействии на них ионов тяжелых металлов [5,7]. Сопоставляя результаты этого эксперимента и эксперимента по изучению сорбции металлов микроорганизмами (пп.2.1.5. и 2.1.6.) можно говорить о том, что сорбция ведется и мертвой культурой, что подтверждает физический характер сорбции при использовании микроорганизмов.

Результаты изучения адсорбции микроорганизмов мхом (п.2.1.10.) сведены в таблицу 2.7.. Таблица 2.7

Концентрация микробной суспензии после разведения ее до 50мл, кл/мл Оптическая плотность (D) разбавленной суспензии до опыта Оптическая плотность (D) суспензии после проведения опыта Концентрация микробной суспензии после проведения эксперимента, кл/мл (рис.2.15.) Фактическая концентрация, определенная путем высева на агаризованную среду, кл/мл
6,8*10 7 0,092 0,073 5,07*10 7 4,5*10 7
6,8*10 7 0,092 0,069 5,07*10 7 5*10 7
6,8*10 7 0,092 0,071 5,07*10 7 4*10 7
Согласно результатам этого эксперимента можно говорить о том, что мох губительно воздействует на микроорганизмы так, в результате исследований (п.2.1.10) концентрация микроорганизмов снизилась с 6,8*10 7 до 5,07*10 7 кл/мл.

Данные свойства мха могут в дальнейшем найти применение в медицине, при использовании мха как энтеросорбента. > Концентрация микробной суспензии, кл/мл*10 9 Рис. 2.15. Можно сделать следующие выводы по итогам исследований: Мох является хорошим природным ионообменником и обладает хорошими сорбционными свойствами по отношению к тяжелым металлам, это достигается наличием в структуре мха таких веществ как полиурониды (полисахариды, содержащие карбоксильную группу в 6-пложении пиранового или ангидроглюкозного цикла) и пектина.

Ионообменная емкость мха по меди 0,7 мг-экв/г, по кадмию 0,65 мг-экв/г. Мох оказывает губительное воздействие на микроорганизмы.

оценка доходности облигации в Смоленске
независимое агентство оценки в Белгороде
оценка коммерческой недвижимости в Москве